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  • 生物实验的消毒和灭菌
    2016-11-04 12:09  

    消毒和灭菌的基本常识对于实验室生物安全是至关重要的。由于严重污染的物品不能迅速地消毒或灭菌,因此了解预清洁的基本原理也同样重要。关于消毒和灭菌,以下基本原则适用于所有已知不同级别的微生物病原体。

        关于清除污染的特殊要求,要根据实验工作的类型以及所操作的感染性物质的特性来决定。这里所提供的一般性资料,可用于建立标准的和更专门的程序,以处理特定实验室中所涉及的生物危害。消毒剂的作用时间因具体的品种和生产商而不同。因此,所有消毒剂使用的推荐意见均必须遵守生产商的说明。

    一、定义 

    关于消毒和灭菌有许多不同的术语,下面是生物安全中较常用的:

    抗菌剂(antimicrobial)能够杀死微生物或抑制它们生长和繁殖的制剂。

    防腐剂(antiseptic)能够抑制微生物生长和繁殖但不足将其杀灭的物质。防腐剂经常

    应用于体表。

    生物杀灭剂(biocide)所有能够杀死生物体的制剂的统称。

    化学杀菌剂(chemicalgermcide)用于杀死微生物的化学品或化学混合物。

    清除污染(decontamination)去除和/或杀死微生物的任何过程。该词也用于去除或中和有

    危害的化学品和放射性物质。

    消毒剂(disinfectant)用于杀死微生物的化学品或化学混合物,但不一定杀死其孢子。

    消毒剂常用于非生命物体或其表面。

    消毒(disinfection)杀死微生物的物理或化学手段,但不一定杀死其孢子。

    灭菌剂(microbicide)能够杀死微生物的化学品或化学混合物。该词常常可以代替“生物杀灭剂”、“化学杀菌剂”或“抗菌剂”。

    杀孢子剂(sporocide)用于杀死微生物和孢子的化学品或化学混合物,灭菌(sterilization)杀死和/或去除所有微生物及其孢子的过程。

    二、实验室材料的清洁

        清洁是指去除污垢、有机物和污渍。清洁方法包括刷、吸、干擦、洗涤或用浸泡肥皂水或清洁剂的湿墩布拖擦。尘土、污物以及有机物是微生物的栖身之所,并可能影响除污染剂(抗菌剂、化学杀菌剂以及消毒剂)的杀菌作用。

        必须通过预清洁才能实现消毒和灭菌的目的。许多杀菌剂只对经过预清洁的物品才具有杀菌活性。预清洁时必须小心,以避免暴露于感染性物质。

        预清洁时必须使用与以后使用的杀菌剂化学上相容的物质。非常普遍的是采用相同的化学杀菌剂进行预清洁和消毒。

    三、化学杀菌剂

        多种化学品可以用作消毒剂和∕或防腐剂。由于其数量与种类还在不断增加,因此,要根据具体的用途认真选择。

        许多化学品在较高温度时其杀菌效果更快也更好。但同时,较高的温度能够加速其挥发和降解。因此在热带地区,由于室温较高,可能缩短化学杀菌剂的有效期,在使用和储存这些化学品时要特别注意。

        许多杀菌剂对人或环境有害,应当按生产商的说明小心地进行选择、贮存、操作、使用和废弃。为了个人的安全,建议在稀释化学杀菌剂时应戴手套、围裙和保护眼睛的器具。

        化学杀菌剂一般不用于地面、墙壁、设备和家具的常规清洁。但是,在控制疾病暴发时可以使用。正确使用化学杀菌剂可以确保实验场所的安全,减少来自感染性物质的危险。只要可能,出于经济原因、控制库存以及限制环境污染等的考虑,应尽可能控制所使用化学杀菌剂的量。

        下面介绍一些常规使用的化学杀菌剂,并列出它们的一般用途和安全特征。除非另外标注,杀菌剂的浓度用重量/体积(w/v)来表示。表12汇总了含氯消毒剂的推荐使用浓度。

    表 12  含氯消毒剂的推荐使用浓度

    “清洁”情况下 “污染”情况下
    所需的有效氯浓度 0.1%(1g/L) 0.5%(5g/L)
    次氯酸钠溶液(含有5%的有效氯) 20mL/L 100mL/L
    次氯酸钙(含有70%的有效氯) 1.4g/L 7.0g/L
    二氯异氰尿酸钠粉剂(含60%的有效氯) 1.7g/L 8.5g/L
    二氯异氰尿酸钠片剂(每片含1.5g有效氯) 每升1片 每升4片
    氯胺(含有25%的有效氯) 20g/L 20g/L

    氯(次氯酸钠)

        氯属于快速作用的氧化剂,是一种可广泛应用的广谱化学杀菌剂。它一般以次氯酸钠(NaOCl)溶液来作为漂白剂销售,使用时可以用水稀释成各种不同的有效氯浓度。氯(尤其用作漂白剂时)是强碱性的,能够腐蚀金属。有机物(蛋白质)会显著减弱其活性。如果在开口容器中储藏高浓度的或使用浓度的漂白剂,尤其在高温条件下,会释放氯气而减弱其杀菌能力。要根据漂白剂工作液的初始浓度、容器的类型(如有无盖子)和大小、使用的频率和特性以及室内条件,来确定它们的更换频率。一般而言,对于那些需要一天多次浸泡处理含有高浓度有机物的材料的漂白剂溶液,应当至少每天更换一次,而那些使用频率较低的漂白剂溶液,则可以维持一周时间。

        常规实验室消毒剂的有效氯浓度应为1g/L。推荐使用含有5g/L有效氯的更强作用的溶液来处理生物危害性物质的溢出以及含有大量有机物的情况。作为家用漂白剂的次氯酸钠溶液含有50g/L的有效氯,因此分别需要进行1﹕50或1﹕10的稀释来达到终浓度1g/L和5g/L。工业用漂白剂的次氯酸钠溶液含有近120g/L的有效氯,必须进行相应的稀释来达到上述浓度。

        次氯酸钙[Ca(ClO)2]的颗粒或片剂一般含有70%的有效氯。用颗粒或片剂配制浓度1.4g/L或7.0g/L的溶液,其有效氯浓度分别为1.0g/L和5g/L。

        不建议将漂白剂当作防腐剂使用,但可以用作普通目的的消毒剂以及用于浸泡非金属类的污染材料。在紧急情况下也可以用终浓度含1~2mg/L有效氯的漂白剂来消毒饮用水。

        氯气具有强毒性。因此漂白剂只能在通风良好的地方储存和使用。另外,漂白剂也不能与酸混合以避免氯气快速释放。氯的许多副产物可能对人体及环境有害,应该避免滥用含氯消毒剂,特别是漂白剂。

    二氯异氰尿酸钠

        二氯异氰尿酸钠(NaDCC)的粉剂含有60%的有效氯。用NaDCC粉剂配制的浓度为1.7g/L和8.5g/L的溶液将分别含有1g/L和5g/L的有效氯。NaDCC片剂一般每片含有1.5g的有效氯,将1片或4片溶于1升水将分别获得浓度约为1g/L和5g/L的溶液。粉剂或片剂的NaDCC储存既方便又安全。血液或其他生物危害性液体溢出时,可以使用固体NaDCC,并使其作用至少10min后再除去,然后对污染区进行进一步的清理。

    氯胺

        氯胺粉剂含有大约25%的有效氯。氯胺释放氯的速度比次氯酸慢,因此如果需要获得同次氯酸相同的效力,就需要较高的初始浓度。另一方面,有机物对氯胺溶液的影响没有次氯酸溶液

        那么大,在“清洁”和“污染”情况下都推荐使用20g/L的浓度。氯胺溶液实际上无臭味。但是,浸泡在氯胺中的物品必须要彻底清洗,以除去加入到氯胺-T(甲苯磺酰氯醛甲酰胺钠)粉剂中的填充剂的残留物。

    二氧化氯

        二氧化氯是一种高效的快速杀菌剂、防腐剂和氧化剂。经常有报道,认为其在浓度低于漂白粉的含氯浓度时即具活性。二氧化氯作为气体是不稳定的,将分解为氯气(Cl2)和氧气(O2),并放热。然而,二氧化氯溶于水,并在水溶液中稳定。有两种方法可获得二氧化氯:(1)将盐酸(HCl)和亚氯酸钠(NaClO2)两种单独成分混合时即可生成;(2)订购其稳定态,然后在需要时随时活化生成。就氧化杀菌剂而言,二氧化氯是高选择性的氧化剂。臭氧和氯比二氧化氯有更高的反应活性,能氧化大多数的有机物。然而,二氧化氯仅同还原性硫化物、仲胺、叔胺以及其他强还原性和反应活性的有机物作用。因此,与使用氯和臭氧相比,二氧化氯在含量低得多的情况下,能得到更稳定的反应产物。在有机物较多的情况下,由于其选择性,使用适量的二氧化氯比臭氧和氯更有效。

    甲醛

        在温度高于20℃时,甲醛(HCHO)是一种能够杀死所有微生物及其孢子的气体。但甲醛对朊蛋白没有杀灭活性。

        甲醛起效相对较慢,并需要相对湿度达70%左右。市场上出售的产品为多聚甲醛——一种固体多聚体,呈薄片状或小块状,或为福尔马林——一种浓度约为370g/L(37%)的气体水溶液,其中含甲醇(100mL/L)作为稳定剂。两种形式加热都可以产生气体,用于封闭空间(如生物安全柜和房间)的清除污染和消毒(见本章“清除局部环境污染”部分)。甲醛(5%福尔马林水溶液)可以作为液体消毒剂。

        甲醛被怀疑是一种致癌剂。它具有刺鼻的气味,其气体能够刺激眼睛和黏膜,因此必须在通风橱或通风良好的地方储存和使用。必须遵守国家化学品安全规定。

    戊二醛

        象甲醛一样,戊二醛[OHC(CH2)3CHO]也对繁殖的细菌、孢子、真菌和含脂或不含脂的病毒具有活性。它不具有腐蚀性,比甲醛作用迅速,但也需要几个小时才能杀死细菌孢子。

        通常所供应的戊二醛是浓度约20g/L(2%)的溶液,绝大部分产品使用前需要加入与产品一同提供的碳酸氢盐混合物进行“活化”(变成碱性)。活化的溶液根据其配方设计、应用类型和使用频率等情况可以重复使用1~4周。与有些产品一同提供的指示计(dipstick)仅用于粗略指示溶液中的活性戊二醛水平。如果戊二醛溶液变混浊,就应当将其废弃。

        戊二醛具有毒性,并对皮肤和黏膜具有刺激性,应当避免与其接触。必须在通风橱或通风良好的地方使用。不建议采用其喷雾剂或溶液来清除环境表面的污染。必须遵守化学品安全的国家规定。

    酚类化合物

        酚类化合物是一大类最早使用的杀菌剂。但是,最近出于安全考虑而限制了它的使用。它们对繁殖细菌和含脂病毒具有活性,适当配制后,对分枝杆菌也有活性。它们对孢子没有活性,而对于非含脂病毒的活性则不确定。许多酚类产品可用于清除环境表面的污染,有些(如三氯生和氯二甲酚)是最常用的抗菌剂。

        三氯生常作为洗手用品。它主要对繁殖的细菌有活性,并且对皮肤和黏膜是安全的。但是,实验研究发现,对低浓度三氯生具有耐受性的细菌对某些抗生素也有耐受性。该领域中这一发现的意义还不清楚。

        有些酚类化合物对水的硬度敏感,并可能导致失活,因此必须使用蒸馏水或去离子水来进行稀释。

        不建议在食物接触的表面和幼儿活动场所使用酚类化合物。它们可能被橡胶吸收,也可能渗透皮肤。必须遵守国家化学品安全规定。

    季铵盐类化合物

        季铵盐类化合物大多混合使用,也经常与醇类等其他杀菌剂联合使用。季铵盐类化合物对繁殖的细菌和含脂类病毒具有良好活性。某些类型(如苯扎氯铵)也用作防腐剂。

        有些季铵盐类化合物的杀菌作用会受有机质、水的硬度以及阴离子去污剂的显著影响,因此当使用季铵盐化合物进行消毒时,要认真选择预清洁所用的品种。有些具有潜在危害性的细菌能够在季铵盐化合物溶液中生长。由于其生物降解能力较低,这些化合物也可能在环境中蓄积。

    乙醇

        乙醇(C2H5OH)和异丙醇[(CH3)2CHOH]具有相似的灭菌特性。它们对于繁殖的细菌、真菌和含脂病毒具有活性,但不能灭活孢子,而对非含脂病毒的作用则不确定。其水溶液最有效的使用浓度约为70%(v/v);更高或更低的浓度均不适宜杀菌。醇类溶液的主要优点是处理后物品不会留下任何残留物。

        将乙醇与其他试剂混合使用比单独使用更有效,如70%(v/v)乙醇和100g/L的甲醛混合使用,以及使用含有2g/L有效氯的乙醇。70%(v/v)乙醇溶液可以用于消毒皮肤、实验台和生物

        安全柜的工作台面,以及浸泡小的外科手术器械。由于乙醇可以使皮肤干燥,所以经常与润滑剂混合使用。在不便于或不可能进行彻底洗手的情况下,推荐使用含乙醇的擦手液对轻度污染的手进行消毒。但是必须记住,乙醇对孢子无效,而且不能杀死所有类型的非含脂类病毒。

        乙醇是易挥发和易燃的,不能在明火附近使用。其工作液应储存在适当的容器内以避免醇类挥发。乙醇可以硬化橡胶并溶解某些胶质。为了避免乙醇用于其他非灭菌目的,在实验室里对

        乙醇进行专门的清点和储存是非常重要的。含有乙醇溶液的瓶子必须清楚标记以避免被意外高压灭菌。

    碘和碘伏

        这类消毒剂的作用与氯类似,只是有机质对它们的抑制作用略弱。碘可以使纤维和环境表面着色,一般不适合作为消毒剂。但是,碘伏和碘酊是很好的抗菌剂。多聚碘(polyvidoneiodine)是一种安全可靠的外科手术擦手剂和手术前皮肤抗菌剂。碘类抗菌剂一般不适于医疗/牙医器械的消毒。碘不能在铝或铜上使用。碘有毒性。含有有机碘的产品必须于4~10℃储存,以避免有潜在危害性的细菌在里面生长。

    过氧化氢和过氧乙酸

        像氯一样,过氧化氢(H2O2)和过氧乙酸(CH3COOOH)是强氧化剂,是一种广谱杀菌剂。对人和环境它们较氯更为安全。

        通常供应的过氧化氢是可以立即使用的3%的溶液,或是用无菌水稀释5~10倍体积后使用的30%的水溶液。但是,那种单独含有3~6%过氧化氢的溶液杀菌作用缓慢而有限。现有产品中含有其他成分来稳定过氧化氢,加速其杀菌作用并降低其腐蚀性。

        过氧化氢能够用于清除实验台和生物安全柜工作台面的污染,较高浓度的溶液适于清除对热敏感的医疗∕牙医器械的污染。采用过氧化氢或过氧乙酸熏蒸来消毒对热敏感的医疗/牙医器械时,需要特殊的设备。

    过氧化氢和过氧乙酸能腐蚀铝、铜、黄铜和锌等金属,也能使纤维、头发、皮肤及黏膜褪色。经它们处理的物品必须经过彻底的漂洗后才能接触眼睛和黏膜。它们应当储存在避热和避光的地方。

    四、清除局部环境的污染

        需要联合应用液体和气体消毒剂来清除实验室空间、用具和设备的污染。清除表面污染时可以使用次氯酸钠(NaOCl)溶液;含有1%有效氯的溶液适于普通的环境卫生设备,但是当处理高危环境时,建议使用高浓度(5g/L)溶液。用于清除环境污染时,含有3%过氧化氢的溶液也可以作为漂白剂的代用品。

        可以通过加热多聚甲醛或煮沸福尔马林所产生的甲醛蒸气熏蒸来清除房间和仪器的污染。这是一项需要由专门培训的专业人员来进行的、非常危险的操作。产生甲醛蒸气前,房间的所有开口(如门窗等)都应用密封带或类似物加以密封。熏蒸应当在室温不低于21℃且相对湿度70%的条件下进行(见本章“清除生物安全柜的污染”部分)。

        清除污染时气体需要与物体表面至少接触8h。熏蒸后,该区域必须彻底通风后才能允许人员进入。在通风之前需要进入房间时,必须戴适当的防毒面具。可以采用气态的碳酸氢铵来中和甲醛。采用过氧化氢溶液对小空间进行气雾熏蒸同样有效,但需要专门的蒸气发生设备。

    五、清除生物安全柜的污染

        清除Ⅰ级和Ⅱ级生物安全柜的污染时,要使用能让甲醛气体独立发生、循环和中和的设备。应当将适量的多聚甲醛(空气中的终浓度达到0.8%)放在电热板上面的长柄平锅中(在生物安全柜外进行控制)。然后将含有比多聚甲醛多10%的碳酸氢铵置于另一个长柄平锅中(在生物安全柜外进行控制)。在柜外将该平锅放置到第二个加热板上,在安全柜外将电热板接上插头通电,以便需要时在柜外通过开关电源插头控制盘子的操作。如果相对湿度低于70%,在使用强力胶带[如管道胶带(ducttape)]密封前部封闭板前,还要在安全柜内部放置一个开口的盛有热水的容器。如果前部没有封闭板,则可以用大块塑料布粘贴覆盖在前部开口和排气口以保证气体不会泄漏进入房间。同时供电线穿过前封闭板的穿透孔须用管道胶带密封。

        将放有多聚甲醛平锅的加热板插上插头接通电源。在多聚甲醛完全蒸发时拔掉插头以断电。使生物安全柜静置至少6h。然后给放有第二个平锅的加热板插上插头通电,使碳酸氢铵蒸发。然后拔掉电插头,接通生物安全柜电源两次,每次启动约2秒钟来让碳酸氢铵气体循环。在移去前封闭板(或塑料布)和排气口罩单前,应使生物安全柜静置30min。使用前应擦掉生物安全柜表面上的残渣。

    六、洗手/清除手部污染

        处理生物危害性材料时,只要可能均必须戴合适的手套。但是这并不能代替实验室人员需要经常地、彻底地洗手。处理完生物危害性材料和动物后以及离开实验室前均必须洗手。

        大多数情况下,用普通的肥皂和水彻底冲洗对于清除手部污染就足够了。但在高度危险的情况下,建议使用杀菌肥皂。手要完全抹上肥皂,搓洗至少10秒钟,用干净水冲洗后再用干净的纸巾或毛巾擦干(如果有条件,可以使用暖风干手器)。

        推荐使用脚控或肘控的水龙头。如果没有安装,应使用纸巾或毛巾来关上水龙头,以防止再度污染洗净的手。如上所述,如果没有条件彻底洗手或洗手不方便,应该用酒精擦手来清除双手的轻度污染。

        过滤除菌操作的正确顺序是: 使用前,将滤器和过滤瓶等全部装置用纸包好经高压灭菌 ; 使用时,在无菌操作条件下将滤器安装到过滤瓶上;用橡皮管以无菌操作将过滤瓶、安全瓶、压差计和抽气系统连接 ;将待过滤液体注入滤器过滤,时间不宜过长,压力控制在100-200mmHg为限;过滤除菌操作时,将菌液注入滤器过滤,时间不宜过长,压力控制在100~200mmHg为宜。

    七、热力消毒和灭菌

        加热是最常用的清除病原体污染的物理手段。“干”热没有腐蚀性,可用来处理实验器材中许多可耐受160℃或更高温度2~4h的物品。干热灭菌是利用热的作用来杀菌,通常在烘箱;干热灭菌效果监测应采用枯草杆菌玄色变种芽孢作生物指示。物燃烧或焚化(见下)也是一种干热方式。高压灭菌的湿热法则最为有效。

        煮沸并不一定能杀死所有的微生物或病原体,但如果其他方法(化学杀菌、清除污染、高压灭菌)不可行或没有条件时,也可以作为一种最起码的消毒措施。灭菌后的物品必须小心操作并保存,以保证在使用之前不再被污染。

        使用高压灭菌器时:灭菌器腔内装载要松散,以便蒸汽作用均匀;灭菌器的排水过滤器应经常拆下清洗;待温度降至80℃以下时才能打开。高压蒸汽灭菌是对实验材料进行灭菌的最有效和最可靠的方法,确保正确灭菌的条件是121℃、灭菌15 分钟而干热灭菌使用温度和时间通常为160-400℃,1-5h;采用熏蒸法灭菌,熏蒸过程至少密闭保持12h;液体和固体物品分开存放。 

        被病原微生物污染的玻璃器皿,应先放在高压灭菌锅中进行消毒灭菌。用玻璃(细菌)滤器过滤含传染性物质时,应先在2%的石炭酸溶液中至少浸泡 2h,然后再洗涤、高压灭菌。

        湿热灭菌较干热灭菌消毒效果更好,使用也较普遍;使用湿热灭菌时,蛋白质在含水多时容易变性,易于凝固;使用湿热灭菌时,蒸汽具有潜热,当蒸汽与被灭菌的物品接触时,可凝结成水而放出潜热,使温度迅速升高,加强灭菌效果。

    八、紫外线杀菌

        紫外线消毒方便实用,紫外灯可以是固定式,也可以是活动式的,但离被照射物不应超过1.2M,开启的紫外灯时不可以在紫外灯下工作。紫外线消毒时不能同时开启日光灯和紫外灯;紫外线消毒方便实用,但不能彻底灭菌,特别是对细菌的芽孢杀灭效果较差;


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